Среда КриоМед-П на основе ДМСО

1. Взять культуру с плотностью монослоя 70-80% (для клеток прикрепляемых культур), или 50-70% плотности суспензии (для клеток суспензионных культур).

2. Снять клетки прикрепляемых культур с субстрата при помощи диссоциирующего раствора Трипсин-ЭДТА 0,05% в течение 5 минут при 37^оС (предварительно ополоснуть монослой клеток изотоническим раствором, не содержащим ионов Ca²⁺ и Mg²⁺). Клетки суспензионных культур пипетировать и собрать в центрифужной пробирке.

3. Инактивировать трипсин при помощи: среды, содержащей 2-10% сыворотки (для сывороточных культур) или рабочего раствора ингибитора трипсина из плодов сои (0,2 мг/мл) – (для бессывороточных или сывороточных культур).

4. Осадить клетки, центрифугируя при 1000 об/мин 5-7 минут. Удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок.

5. Ресуспендировать клетки в среде «КриоМед-П» из расчета 0,5-2,0 млн/мл.

6. Разлить приготовленную криосуспензию по криопробиркам, герметично укупорить замораживаемые образцы.

7. Поместить замораживаемые образцы в специальный криоконтейнер с крышкой, можно в бокс из пенопласта и поместить его для медленного охлаждения в морозильник (-20^оС) в течение 1 часа.

8. Перенести бокс с образцами в морозильник глубокой заморозки (-70^оС) на 8-12 часов.

9. Быстро перенести образцы в жидкий азот (-197^°С) для длительного хранения.

Размораживание клеток:

•Полностью разморозить содержимое криопробирок при 37^оС.

•Мягко ресуспендировать клетки и однократно отмыть в среде культивирования или изотоническом растворе (1мл криообразца на 4мл среды, раствора), центрифугировать при 1000 об/мин 5-7 минут.

•Ресуспендировать клетки в среде культивирования и посадить в культуральном флаконе 25 см².

•При необходимости, перед пассажем оценивают количество жизнеспособных клеток в посевном материале при помощи окрашивания трипановым-синим.

•Для максимального удаления ДМСО рекомендуется произвести полную замену среды через 1 сутки после начала культивирования клеток.

•При работе с крупными, дифференцированными или чувствительными к механическим воздействиям клетками, этап отмывки может быть опущен. Однако, необходима полная замена среды через 1 сутки.

Срок годности: 1 год.

Условия хранения и транспортировки:

Хранить при температуре 2 - 8 ^оС в защищенном от света месте. Транспортировать всеми видами крытого транспорта при температуре 2- 8 ^оС.